1.常见样本类型:
分泌物、血液、脾脏、扁桃体、肾脏和淋巴结等样本中的非洲猪瘟。
2.. 样品预处理方式(样本处理区)
2.1 样本前处理
2.1.1组织样品:每份组织分别从 3 个不同的位置称取样品约 1g,手术剪剪碎混匀后取
0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理盐水后继续研磨,待匀浆后转至 1.5mL 灭菌离心管中,8000rpm 离心2min,取上清液 200μL 于 1.5mL 灭菌离心管中;病样组织直接上机提取也有实验室在用(江苏泰州农委)
2.1.2全血样本:取全血离心后的上清(血清) 200μL 于 1.5mL 灭菌离心管中。
相关实验设备:动物组织研磨仪、手持式电动组织研磨仪
2.2样本保存和运输
上述标本短期内可保存于-20℃,长期保存可置-70℃,但不能超过 6 个月,标本运送应采用 蓝冰和干冰运输,严禁反复冻融。
2.3 DNA 提取
对上述处理好的标本加入到预装好提取试剂的96深孔板中,将加好样本的耗材放置到96全自动核酸提取仪中提取核酸。
3. 试剂配制(试剂准备区)
根据待检测样本总数,设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照;样品每满 7 份,多配制 1 份),将上游引物、下游引物、荧光定量探针、酶液预混好,将混合好反应液分装到 PCR 反应管中。举例如下:
4. 加样(样本处理区)
将提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取一定量,分别加入相应的反应管中,盖好管盖,混匀,短暂离心。
5.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内;
5.2 设置好通道、样品信息,反应体系设置为 20μL;
荧光通道选择: 检测通道(Reporter Dye)FAM, 淬灭通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光,选择 None 即可。
5.3 相关设备:
BTK-6 荧光PCR仪、BTK-10 超快速荧光PCR仪、ABI7500、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
6. 结果分析判定
按照非洲猪瘟核酸检测试剂盒指导进行判读。